Xbox: May the 4th be with you!!

어제 5월 4일이 영어로는 스타워즈의 인사말과 같다는 이유로 Xbox 사이트에서 스타워즈 관련 제품 할인 행사를 했다.

평소 아이들이랑 할만한 게임을 찾고 있었는데, 언젠가 레고 시리즈 게임을 좋아했었던 기억이 나서, 행사중인 ($19.99에서 $4.99) 360용 스타워즈 3를 구입하고 싶어졌다.

보라~ 이 매력적인 가격들을!!!

그런데, 이 행사에 참여를 할려면 유료인 Xbox Gold 회원이어야 된다고 한다.

고민할 새도 잠시, Xbox one구입할 때 받았던 여러 쿠폰들이 생각이 났다.

찾아보니, 정말로 이주 동안 사용할 수 있는 쿠폰이 있었다.

부푼 마음으로 등록 (골드 회원에겐 무료 게임도 주어진다고 하니, 그것도 기대!!), 구입하려는 화면으로 가 보았다.

하지만 가격은 원래 가격 그대로 $19.99!!!

왜지??

이주짜리라서 너무 짧아서 그런가?

다른 게임 살 때 들어있던, 한달짜리 쿠폰이 보이길래 그것도 넣어봤다.

결과는... 골드 회원 기간이 한달 반으로 늘어났다.

이때부터 FAQ를 비롯 광범위한 구글링에 들어갔다.

그러다 어느 구석탱이에서 발견한 글귀

이런 오퍼는 보통 paid member에게만 해당될 수도 있다는 것이었다.

이 글이 왜인지 믿음이 가기 시작!

그럼 제일 싼 걸로 회원권을 구입해야지 하고 보니, 프로모션인지 모르겠지만, 한달에 1불짜리가 보였다 (보통은 일년에 60불이다).

그래서 그걸로 구입을 해보았다.

싸도 유료회원은 유료회원이니까!

하지만 결과는 골드 회원 기간 한달 더 연장!

구입하고픈 게임은 여전히 $19.99

웹브라우저 캐시도 지우고 다른 웹브라우저도 이용해 봤으나 가격은 변하질 않았다.

젠장.

모르겠다 그냥 자자 하고 잤다.

그러곤 일어나 평소처럼 출근후 월급 루팡을 하다보니, 어제의 일이 생각나 그냥 한번 다시 xbox 사이트를 방문해 보았다.

그랬더니... 빙고!

할인된 가격으로 몇 번의 클릭으로 구매할 수 있었다.

하지만 골드 회원에게 주는 이달의 무료 게임은 여전히 접근이 불가능했다.

혹시 왜인지 알게 되는 날이 올지, 아니면 그냥 60불 내고 유료회원이 될지 궁금해진다~

Thermo service engineer visit

결국 이 문제를 직접 해결하기엔 무리가 있다고 판단, Thermo에 인력 투입 요청을 하게 된다.

이왕 하는 김에, 그동안 미뤄 두었던 preventive maintenance (PM)를 받기로 했다.

현재 우리와 계약을 EASY-nLC 1000과 Orbitrap Fusion 함께 맺은 상태여서, 한번에 모두 끝내기로 했다.

이번에 오실 분은 설치해 주셨던 분이 아니라, 옆동네에서 오시는 분이라 잘 몰랐는데, 만나보니 경험 많은 할아버지셨다.

경험이 많으신 분이 오신 것에 대해서는 감사했으나, 안타깝게도 부인이신 분 건강상태가 좋질 않아서 계획했던 PM은 나중으로 미루고, 우선 leak만 잡기로 했다.

전체 시스템을 sensor나 tee를 기점으로 분획을 나누어, 작은 부분들을 대상으로 leak test를 수행한 결과, syringe valve와 waste valve의 rotor seal에서 문제를 발견했으며, 또한 stainless steel로 된 line들 두개 (펌프에서 압력 센서까지, 압력 센서에서 valve까지)를 갈아야 했다.

valve의 rotor seal

Flow line: LC512

Flow line: LC513

이렇게 예상 밖의 대공사가 끝나니 비로소 모든 테스트를 통과할 수 있었다 (그리고 엔지니어께서는 재빨리 댁으로 가셨다).

이 모든 작업은 우리가 가지고 있는 warranty로 커버 되었으나, 단순한 호기심이 생겼다.

과연 이 부품들은 얼마일까?

그래서 Thermo의 Aftermarket LCMS Group에 문의를 해보았다.

두둥~

우선 rotor valve (= rotor seal, LC228)은, 그 자그마한 플라스틱 쪼가리 하나에 $335 (대략 40만원) 이란다.

그리고 stainless steel로 된 라인들 (LC512, LC513)은 각각 $150 (18만원선) 이네...

그리고 먼저번에 갈았던 pump seal (LC510)은 4개들이 한세트에 $650 (78만원선) 이라고 한다.

이번에 발생한 leak를 막기위해 들어갔던 순수 재료비를 따져 보자면....

Rotor seal 3개 : $335 x 3 = $1005

Stainless steel line 2개: $150 x 2 = $300

Pump seal 1개: $650 / 4 = $162.50

합이 $1467.50 (175만원) 이네... 젠장.

보증기간 (5년)이 지난 다음에 어떻게 유지 보수를 해야할 것인지... 조금 두려워진다.

Seal replacement for EASY-nLC 1000

Leak을 잡기 위한 노력은 계속되고 있다.

우선 엔지니어가 알려준대로 rotor seal을 갈기로 했다.

Rotor seal: LC228 (= VICI C72-16R6)

Thermo에서 나온 part number는 LC228이었으며 다행히 작년에 설치하고 난 뒤 여분의 부품이 있었다.

교체 방법 역시 제품 매뉴얼에 상세히 나와 있어서 그리 어렵지 않았다.

하지만, 이 부품 교체 후에도 여전히 leak test를 통과하지 못해서 결국 그 다음 우선 순위에 있는 pump seal 역시 갈아보았다.

사실 자세히 살펴보니, pump seal 주위에 뭔가 액체가 흐른듯한 흔적이 보이기도 했다.

잘 보면 액체가 흐른 흔적이 펌프 헤드 주위에 보인다.

Pump seal 역시 설치후 남은 부속품 상자에서 찾을 수 있었으며, 교체 방법 역시 어렵지 않았다.

Pump seal: LC510

하지만 이렇게까기 했는 데도 불구하고, leak는 잡지 못했다.

결국 새는 곳이 한두군데가 아니었던 것이다.

이렇게 leak hunting은 계속된다...

Genomic DNA extraction – Dellaporta mehtod

·         Pros: Speedy, cheap, less dangerous (no phenol or chloroform)

·         Cons: No good with polysaccharides or phenolic complexes, impurities

·         You can expect to get 20 ug from 100 mg of tobacco leaf or 3 ug from 100 mg of Arabidopsis

           1. Materials

·         Extraction buffer (EB)

o    50 mM Tris-HCl, pH 8.0

o    10 mM EDTA, pH 8.0

o    100 mM NaCl

o    1% SDS

o    10 mM beta-mercaptoethanol

o    Liquid nitrogen

o    5 M Potassium acetate, pH 7.5

o    Isopropanol

o    80% EtOH

o    3 M Sodium acetate, pH 5.2

o    65ºC Temperature block or water bath

o    E-tube

o    Falcon 2059 tubes

o    Miracloth (Calbiochem 475855) filters

o    Powder Funnel (15 mm Stem)

o    Spatula

o    pestle and mortar

            2. Procedure

a)     Freeze 1 g of plant material in liquid N2.  Grind to a very fine powder in a cooled mortar and pestle.

v Add liquid N2 to keep material frozen and brittle.

b)    Transfer powder to a 30 ml tube and add 15 ml of extraction buffer.

c)     Add 1 ml 20% SDS and mix thoroughly by shaking.  Incubate tube(s) at 65ºC for 10 min.

d)    Add 5 ml of 5M Potassium acetate and shake.  Incubate tube(s) at 0ºC for at least 20 min.

e)     Spin tube(s) at 25,000xg (14,500 rpm in SS34 rotor) for 20 min.  

f)      Pour supernatant through "Miracloth" (Miracloth can be obtained from Calbiochem Corporation, Lajolla, CA92037, U.S.A.) filter into fresh tube containing 10 ml isopropanol.

g)     Mix and incubate at -20ºC for 30 min.

h)    Spin tube(s) at 20,000xg for 15 min (13,000 rpm in SS34 rotor).  

i)       Pour off supernatant and allow tube(s) to drain by inverting tube(s) on a paper towel.

j)       Redissolve pellet in 0.7 ml of 50mM Tris, 10mM EDTA, pH 8 and transfer to Eppendorf tube(s).  Spin in microfuge for 10 min to pellet insoluble debris.

k)    [Optional...] Transfer supernatant to fresh Eppendorf tube(s), add an equal volume of 1:1 Phenol/Chloroform, mix and spin in microfuge for 10 min.

l)       Transfer aqueous phase to fresh Eppendorf tube(s), add 1/10 volume 3M sodium acetate (75 ul) and 500 ul isopropanol.

m)  Mix well and pellet DNA by brief centrifugation in microfuge.  Wash pellet with 1 ml of ice-cold 80% ethanol.  Dry pellet and redissolve in 100 ul 10mM Tris, 1mM EDTA, pH 8.

Genomic DNA extraction – using a CTAB buffer

·         You’ll get a relatively clean genomic DNA from a sample with phenolic compounds or polysaccharides using this method.

1.     Materials

·         2x CTAB buffer

2% (w/v) CTAB (cetyltrimethylammonium bromide) (Spectrum Chemical Mfg. Corp., Sigma)

100 mM Tris-HCl, pH 8.0

20 mM EDTA, pH 8.0

1.4 M NaCl

1% polyvinylpyrrolidine (mw 40,000) (Sigma)

·         CTAB precipitation buffer

1% (w/v) CTAB

50 mM Tris-HCl, pH 8.0

10 mM EDTA, pH 8.0

·         1x CTAB

Dilute 2x CTAB

·         TE

·         CsCl solution

10 g CsCl/10 mL TE

·         10 mg/mL EtBr solution

·         20x SSC saturated 2-propanol

Using a upper part when you mix 100 mL of 2-propanol and 50 mL of 20x SSC

·         Chloroform

·         70%, 100% EtOH

·         20x SSC

2.     Procedure

a.      Preheat 2x CTAB and 1x CTAB in 65ºC water bath. Wash a plant sample with ddw and remove an excessive water using a paper towl.

b.     Freeze 10 g of fresh tissue with liquid N2 and grind with pestle and mortar.

c.      Transfer the powder into centrifuge tube.

d.     Add 1 mL of preheated 2x CTAB buffer per gram of powder and mix them.

e.      Add 4 mL of preheated 1x CTAB buffer per gram of powder and mix them. And keep it in 65ºC water bath for 5 min.

f.       Add 10 mL of chloroform and mix them well.

g.     Centrifuge it for 5 min at 12,000 rpm, 4ºC.

h.     Transfer the supernatant to new tube.

i.       Add 2 volume of CTAB precipitation buffer and mix them briefly.

j.       Keep it for 30 min at RT.

k.     Centrifuge it for 5 min at 12,000 rpm, RT

l.       Discard the supernatant and dry the precipitant briefly.

m.   Add 4 mL of CsCl solution per 5 g of sample and dissolve it (it may take more than 1hr).

n.     Add 0.1 mL of EtBr and mix them briefly.

o.     Transfer the solution into ultracentrifuge tube and seal it.

p.     Ultracentrifuge it for 6hrs at 65,000 rpm or overnight at 55,000 rpm at 15ºC.

q.     Pick up the DNA band using a syringe and transfer it to E-tube.

r.       Add 0.5 mL of 20x SSC saturated 2-propanol and mix them. Transfer the clear bottom part.

s.      If the DNA band is strong, add 2x volume of ddw and 8x volume of cold 95% EtOH into (p) and mix them.

t.       After the ultracentrifuge, wash the precipitant with cold 70% EtOH.

u.     Discard supernatant and dry the precipitant (DNA).

v.     Add 0.5 mL of TE buffer and dissolve it.

w.   You can dialyze twice times against 1 liters TE buffer per hour to remove remained CsCl instead of EtOH precipitation.

x.     Collect DNA into E-tube using a membrane bag.

Plant genomic DNA extraction (large scale) – Using a Proteinase K buffer

·         You’ll get around 50 ug of genomic DNA from 1 g of plant tissue sample.

·         Expensive but effective

·         Quality is enough for a genomic library preparation.

1.     Materials

·         Proteinase K buffer

0.2 M Tris-HCl, pH 8.0

0.1 M EDTA, pH 8.0

1% sarkosyl (Sigma)

100 ug/mL proteinase K (Sigma)

·         70%, 100% EtOH

·         3 M Sodium acetate, pH 4.8

·         CsCl

·         10 mg/mL Ethidium bromide (EtBr)

·         Ddw-saturated 1-butanol

·         TE

·         Dialysis tube

·         Quick-seal tube (Beckman)

2.     Procedure

a.      Add 0.5~1.5 g of plant tissue with 3 mL of proteinase K buffer into a mortar and grind them.

b.     Transfer it to 15 mL conical tube and stay at 45~50ºC for 1 hour

c.      Centrifuge it for 10 min at 3,000 rpm

d.     Transfer the supernatant to a new tube and adjust the volume to 3 mL using a proteinase K buffer

e.      Add 6 mL of EtOH and mix. Add 300 uL of 3 M sodium acetate, pH 4.8 and shake it

f.       Centrifuge it for 15 min at 10,000 rpm (SS-34 rotor) and discard its supernatant. Air drying the precipitant.

g.     Dissolve the dried precipitant in 4 mL of TE. If the precipitant seems to have many contaminants, dissolve the precipitant in 3mL of TE and repeat (e) to (g).

h.     Mix it with 4.5g CsCl and 400 uL of EtBr (10 mg/mL).

i.       Centrifuge it for 16~20 hrs at 53,000 rpm (VTi 65 rotor), 20ºC. If you have VTi 80 rotor, you can centrifuge it for 12~16 hrs at 55,000 rpm or 8 hrs at 73,000 rpm.

j.       Transfer the genomic DNA band to E-tube and add same amount of ddw-saturated 1-butanol. Mix well and keep for 2 min.

k.     Centrifuge it for 3 min at 1,500x g (RT) and transfer the water layer to new E-tube. Repeat for 4~6 times until the pink color from EtBr is disappeared.

l.       Dialyze overnight against 2 liters TE buffer to remove remained CsCl.

Genomic DNA extraction - Fast extraction method

·         This method is good for organ with highly accumulated phenolic compounds or seedlings.

1.     Materials

·         Homogenization buffer

1 M NaCl

0.2 M sucrose

0.01 M EDTA

0.03 M Tris-HCl, pH 8.0

·         Lysis buffer

0.25 M EDTA

2.5% (w/v) SDS

0.5 M Tris-HCl, pH 9.2

·         Grind buffer (prepare just before use)

4 homogenization buffer + 1 lysis buffer

·         3 M Potassium acetate, pH 4.7

·         70%, 100% EtOH

·         10 mg/mL RNase (Sigma)

·         Pellet pestle (Sigma)

2.     Procedure

a.      Freeze 0.25 g of plant tissue samples in liquid N2, put it to E-tube, and grind with pellet pestle.

b.     Add 400 uL of grind buffer and slightly disturb it at 65ºC (prevent to make any bubbles).

c.      Keep it at 65ºC for 30 min.

d.     Add 13.3 uL of 3 M potassium acetate, pH 4.7

e.      Keep it on ice for 30 min.

f.       Centrifuge it for 10 min at 4ºC, 12,000 rpm and transfer the supernatant to E-tube.

g.     Add 700 uL of 100% EtOH and keep it for 2 min at room temperature (RT). Centrifuge it for 10 min at 4ºC, 12,000 rpm.

h.     Discard supernatant. Wash the precipitant with cold 70% EtOH and centrifuge it for 2 min at 4ºC, 12,000 rpm.

i.       Discard supernatant and dry the precipitant. Dissolve the dried precipitant with 40 uL of ddw and 1uL of DNase-free RNase (10 mg/mL).

Genomic DNA extraction - For PCR

·         Pros: You’ll get genomic DNA quickly from any plant (even with trees).

·         Cons: You need to prepare many reagents.

1.     Meterials

·         Lysis buffer (for 100 mL)

2 M Tris-HCL, pH 7.6	2.5 mL
5 M NaCl	2 mL
0.5 M EDTA, pH 8.0	10 mL
ddw	83 mL

Autoclave for 15 min (121ºC)

20% SDS	2.5 mL
14.26 M BME	70.1 uL

·         TEN buffer

·         Phenol, pH 7.5~8

·         Phenol/chloroform (1:1)

·         Chloroform

·         Isopropanol

·         70%, 100% EtOH

·         TE, pH 8.0

·         10 mg/mL RNase

·         Liquid Nitrogen

·         Pellet pestle (Sigma)

2.     Procedure

1.     Put a 100~200 mg of frozen leaf sample (using Liquid N2) into E-tube and grind by pellet pestle

2.     Put 1.2 mL of lysis buffer and wait for 1~2 hrs at room temperature

3.     Centrifuge for 15 min at 12,000 rpm

4.     Transfer the 1.2 mL of supernatant to 2 mL tube

5.     Add 300 uL of phenol (pH 7.5~8) and shake it for 10 sec. Wait for 2 min at RT

6.     Add 300 uL of chloroform and shake well

7.     Centrifuge for 3 min at 12,000 rpm

8.     Transfer the 1.1 mL of supernatant to 2 mL tube. Repeat (2) to (7) and transfer the 1.0 mL of supernatant to new E-tube

9.     Add same amount of chloroform and shake well

10. Centrifuge for 3 min at 12,000 rpm and transfer the 950 uL of supernatant to 2 mL tube

11. Add same amount of isopropanol and wait for 30 min at RT

12. Centrifuge for 15 min at 12,000 rpm and discard the supernatant. Add 1 mL of 70% EtOH to precipitant and keep it for 10 min in ice bucket. Centrifuge it for 5 min at 6,000 rpm and dry lightly (Caution! Don’t fully dry it. It’ll be very hard to resuspend fully dried sample)

13. Add 500 uL of TEN buffer which contains 50 ug/mL of RNase to precipitant and dissolve it

14. Wait for 30 min at 37ºC

15. Extract with 500 uL of phenol, 500 uL of phenol/chloroform, and 500 uL of chloroform

16. Add 0.1 volume of 3 M NaOAc and precipitate with 2.5 volume of 100% EtOH. Repeat (12) to(15)

17. Dissolve it with 50 uL of TE

3.     Cautions!

·         Sample grinding step is the most important step.

·         4ºC also available for step (3) and (12).

·         Quality is more important than Quality at step (10)

·         You can put at most 400 mg for one tube.

·         You can put RNase at step (2) instead of step (13) if the sample amount is not sufficient.

·         Do not use a Vortex. It can degrade genomic DNA.

·         If you use enlarged pipette tip (you can make it by cutting the end of tip), genomic DNA has less chance for degradation.