Protein or Peptide Purification Method

평소 골칫거리가 하나가 있었다.

의뢰 받는 샘플중 대다수가immunoprecipitation (IP) 샘플인데, 이 방법의 마지막 elution step에서 실험실 마다 선호하는 방법이 다르다는 것이다.

게다가, 선호하는 물질들 중 대다수가 mass spectrometry랑 궁합이 안좋은  salt 들이 많다.

이를 해결하기 위해 salt removal spin column이나 trap column 아니면 SDS-PAGE 젤 등을 이용했으나 이 방법들은 비싸거나 (salt removal spin column은 보통 개당 5불 이상씩이다) 번거롭고 (손이 많이가서), 시간이 오래 걸리고, 느낌상 잃어버리는 샘플이 많다는 단점들이 있었다.

그래서 이런 방법들을 사용할 때마다 '어디 좋은 방법없나?' 고민하곤 했다.

그러다 다음의 논문을 발견했다.

내가 RNA-seq을 할때 너무나 좋아했던 (간단해서), magnet nead를 이용한 정제 방법이라니!!!

때마침, salt가 너무 많아서 trypsin digested peptide 상태에서 정제가 필효한 샘플이 나타났고, 그래서 다음과 같이 비교 실험을 하기로 했다.

그리고 그 결과는 다음과 같았다.

크로마토그램만 보자면 확실히, 기존의 trap column을 이용한 방법보다 깨끗해 보인다 (intensity가 낮은 것은 처음 시작한 샘플양의 차이에 기인한다고 본다. 내 마음대로).

Trap column 사용

Magnet bead 사용

그리고 Proteome Discoverer를 통한 분석 결과는 10% 정도 더 많은 유의미한 spectrum을 얻을 수 있었으며, identified protein의 갯수도 그 정도 늘어난 것으로 나타났다.

결과적으로, 너무너무 마음에 드는 방법을 찾아냈다!!!

참고로, 이 실험에 사용한 magnet bead의 가격을 살펴보면 다음과 같다.

논문에 나온 방법대로 hydrophobic한 bead와hydrophilic한 bead를 1:1로 섞어서 쓰다 보니, 위에 나와있는 제품을 가지고 알뜰하게 마지막 1 uL까지 긁어서 쓴다고 치면,

40 uL (20 uL from hydrophobic and the other 20 uL from hydrophilic bead)  for 50 samples
30 mL will be enough for 37,500 samples.
It costs $794.52 (Yep, I forgot to add tax and shipping) for both of the beads.
So, it'll cost $794.52/37500samples = 2 cents per sample.

싸다!!!

이제 상담할 때 자랑할 수 있는 것이 생겼다 (고마워요 논문 저자들!!!)

Weird noise from Orbitrap Velos

갑자기 나의 밥줄인 Orbitrap Velos에서 이상한 소음이 난다.

원래 조용하진 않았지만, 이번엔 다른다.
이상한 high pitch noise가 들린다.

죽지마!!!

Spare tire on 2008 Toyota Sienna

우리 가족의 발이 되어주고 있는 2008년식 Toyota Sienna.

지금껏 만 8년동안 그 흔한 flat tire 한번 없이 (미국 대륙을 2번이나 횡단했음에도 불구하고!!) 아무 말썽 없었는데, 그만 새로 이사한 도시에서 flat tire가 발생했다!!

지리도 익힐겸 주말에 근처 마트 순례를 하던중 주차하려던 순간, 타이어 경고등이 들어온 것을 보았다.

보통 날씨가 추워지거나 일년에 한 두번 바람을 보충해 주어야 할 때, 가끔씩 보던 경고등이라 이번에도 그러겠지 했으나... 아뿔싸 그게 아니었다.

근처 주유소에 있는 에어 펌프로 보충을 해주려 하자, 넣은만큼 바람이 나오고 있었다.

그래서 난생 처음, 운전한지 15년만에 도넛으로 바꾸게 되었는데, 매뉴얼을 보면서 따라해보니 발견한 도넛은 아직 솜털이 보송보송했지만 옆구리에 금이 보였다.

하지만 이 날이 일요일 저녁 7시쯤이라, 어디 부탁할 곳도 없고 해서, 그냥 일단 달고 집으로 왔다.
그 다음날 타이어 전문점에서 새 타이어로 교체할 때까지 30마일 가량을 문제 없이 달리긴 했는데, 금이 간 것을 한번 보고 나니, 너무나 마음이 불안해 졌다.
그래서, 이 타이어를 갈려고 우선 사이즈를 확인해 보니, T155 80/R17 이라는 특이한 숫자를 알게 되었다.

이와 맞는 사이즈의 타이어를 TireRack.com에서 찾아보니.... 왠걸 깜짝 놀랄 가격표를 보여주네...

그렇다, 배송비까지 하면 300불이 넘는 가격!!!
예상했던 것보다, 2배는 되네...
대충 구글링 해보니, 도넛 타이어는 찾는 사람이 별로 없어서 많이 만들질 않아서 비싸단다.

그래서 일단 새로 타이어를 구입하는 것은 보류하고, 대체품을 구입해서 차에 구비해 두는 것으로 일단락 지었다.

바로 지렁이 되시겠다!!

 가격도 저렴하고, 구매 후기를 보니 10년이 지나도 쓸 수 있었다는 이야기가 있길래, 하나 구매해서 차에 두기로 했다.

그나저나, 이런 일을 겪고 나니, 운전할 때 땅바닥을 자주보는 나를 발견하게 된다....

Xbox: May the 4th be with you!!

어제 5월 4일이 영어로는 스타워즈의 인사말과 같다는 이유로 Xbox 사이트에서 스타워즈 관련 제품 할인 행사를 했다.

평소 아이들이랑 할만한 게임을 찾고 있었는데, 언젠가 레고 시리즈 게임을 좋아했었던 기억이 나서, 행사중인 ($19.99에서 $4.99) 360용 스타워즈 3를 구입하고 싶어졌다.

보라~ 이 매력적인 가격들을!!!

그런데, 이 행사에 참여를 할려면 유료인 Xbox Gold 회원이어야 된다고 한다.

고민할 새도 잠시, Xbox one구입할 때 받았던 여러 쿠폰들이 생각이 났다.

찾아보니, 정말로 이주 동안 사용할 수 있는 쿠폰이 있었다.

부푼 마음으로 등록 (골드 회원에겐 무료 게임도 주어진다고 하니, 그것도 기대!!), 구입하려는 화면으로 가 보았다.

하지만 가격은 원래 가격 그대로 $19.99!!!

왜지??

이주짜리라서 너무 짧아서 그런가?

다른 게임 살 때 들어있던, 한달짜리 쿠폰이 보이길래 그것도 넣어봤다.

결과는... 골드 회원 기간이 한달 반으로 늘어났다.

이때부터 FAQ를 비롯 광범위한 구글링에 들어갔다.

그러다 어느 구석탱이에서 발견한 글귀

이런 오퍼는 보통 paid member에게만 해당될 수도 있다는 것이었다.

이 글이 왜인지 믿음이 가기 시작!

그럼 제일 싼 걸로 회원권을 구입해야지 하고 보니, 프로모션인지 모르겠지만, 한달에 1불짜리가 보였다 (보통은 일년에 60불이다).

그래서 그걸로 구입을 해보았다.

싸도 유료회원은 유료회원이니까!

하지만 결과는 골드 회원 기간 한달 더 연장!

구입하고픈 게임은 여전히 $19.99

웹브라우저 캐시도 지우고 다른 웹브라우저도 이용해 봤으나 가격은 변하질 않았다.

젠장.

모르겠다 그냥 자자 하고 잤다.

그러곤 일어나 평소처럼 출근후 월급 루팡을 하다보니, 어제의 일이 생각나 그냥 한번 다시 xbox 사이트를 방문해 보았다.

그랬더니... 빙고!

할인된 가격으로 몇 번의 클릭으로 구매할 수 있었다.

하지만 골드 회원에게 주는 이달의 무료 게임은 여전히 접근이 불가능했다.

혹시 왜인지 알게 되는 날이 올지, 아니면 그냥 60불 내고 유료회원이 될지 궁금해진다~

Thermo service engineer visit

결국 이 문제를 직접 해결하기엔 무리가 있다고 판단, Thermo에 인력 투입 요청을 하게 된다.

이왕 하는 김에, 그동안 미뤄 두었던 preventive maintenance (PM)를 받기로 했다.

현재 우리와 계약을 EASY-nLC 1000과 Orbitrap Fusion 함께 맺은 상태여서, 한번에 모두 끝내기로 했다.

이번에 오실 분은 설치해 주셨던 분이 아니라, 옆동네에서 오시는 분이라 잘 몰랐는데, 만나보니 경험 많은 할아버지셨다.

경험이 많으신 분이 오신 것에 대해서는 감사했으나, 안타깝게도 부인이신 분 건강상태가 좋질 않아서 계획했던 PM은 나중으로 미루고, 우선 leak만 잡기로 했다.

전체 시스템을 sensor나 tee를 기점으로 분획을 나누어, 작은 부분들을 대상으로 leak test를 수행한 결과, syringe valve와 waste valve의 rotor seal에서 문제를 발견했으며, 또한 stainless steel로 된 line들 두개 (펌프에서 압력 센서까지, 압력 센서에서 valve까지)를 갈아야 했다.

valve의 rotor seal

Flow line: LC512

Flow line: LC513

이렇게 예상 밖의 대공사가 끝나니 비로소 모든 테스트를 통과할 수 있었다 (그리고 엔지니어께서는 재빨리 댁으로 가셨다).

이 모든 작업은 우리가 가지고 있는 warranty로 커버 되었으나, 단순한 호기심이 생겼다.

과연 이 부품들은 얼마일까?

그래서 Thermo의 Aftermarket LCMS Group에 문의를 해보았다.

두둥~

우선 rotor valve (= rotor seal, LC228)은, 그 자그마한 플라스틱 쪼가리 하나에 $335 (대략 40만원) 이란다.

그리고 stainless steel로 된 라인들 (LC512, LC513)은 각각 $150 (18만원선) 이네...

그리고 먼저번에 갈았던 pump seal (LC510)은 4개들이 한세트에 $650 (78만원선) 이라고 한다.

이번에 발생한 leak를 막기위해 들어갔던 순수 재료비를 따져 보자면....

Rotor seal 3개 : $335 x 3 = $1005

Stainless steel line 2개: $150 x 2 = $300

Pump seal 1개: $650 / 4 = $162.50

합이 $1467.50 (175만원) 이네... 젠장.

보증기간 (5년)이 지난 다음에 어떻게 유지 보수를 해야할 것인지... 조금 두려워진다.

Seal replacement for EASY-nLC 1000

Leak을 잡기 위한 노력은 계속되고 있다.

우선 엔지니어가 알려준대로 rotor seal을 갈기로 했다.

Rotor seal: LC228 (= VICI C72-16R6)

Thermo에서 나온 part number는 LC228이었으며 다행히 작년에 설치하고 난 뒤 여분의 부품이 있었다.

교체 방법 역시 제품 매뉴얼에 상세히 나와 있어서 그리 어렵지 않았다.

하지만, 이 부품 교체 후에도 여전히 leak test를 통과하지 못해서 결국 그 다음 우선 순위에 있는 pump seal 역시 갈아보았다.

사실 자세히 살펴보니, pump seal 주위에 뭔가 액체가 흐른듯한 흔적이 보이기도 했다.

잘 보면 액체가 흐른 흔적이 펌프 헤드 주위에 보인다.

Pump seal 역시 설치후 남은 부속품 상자에서 찾을 수 있었으며, 교체 방법 역시 어렵지 않았다.

Pump seal: LC510

하지만 이렇게까기 했는 데도 불구하고, leak는 잡지 못했다.

결국 새는 곳이 한두군데가 아니었던 것이다.

이렇게 leak hunting은 계속된다...

Genomic DNA extraction – Dellaporta mehtod

·         Pros: Speedy, cheap, less dangerous (no phenol or chloroform)

·         Cons: No good with polysaccharides or phenolic complexes, impurities

·         You can expect to get 20 ug from 100 mg of tobacco leaf or 3 ug from 100 mg of Arabidopsis

           1. Materials

·         Extraction buffer (EB)

o    50 mM Tris-HCl, pH 8.0

o    10 mM EDTA, pH 8.0

o    100 mM NaCl

o    1% SDS

o    10 mM beta-mercaptoethanol

o    Liquid nitrogen

o    5 M Potassium acetate, pH 7.5

o    Isopropanol

o    80% EtOH

o    3 M Sodium acetate, pH 5.2

o    65ºC Temperature block or water bath

o    E-tube

o    Falcon 2059 tubes

o    Miracloth (Calbiochem 475855) filters

o    Powder Funnel (15 mm Stem)

o    Spatula

o    pestle and mortar

            2. Procedure

a)     Freeze 1 g of plant material in liquid N2.  Grind to a very fine powder in a cooled mortar and pestle.

v Add liquid N2 to keep material frozen and brittle.

b)    Transfer powder to a 30 ml tube and add 15 ml of extraction buffer.

c)     Add 1 ml 20% SDS and mix thoroughly by shaking.  Incubate tube(s) at 65ºC for 10 min.

d)    Add 5 ml of 5M Potassium acetate and shake.  Incubate tube(s) at 0ºC for at least 20 min.

e)     Spin tube(s) at 25,000xg (14,500 rpm in SS34 rotor) for 20 min.  

f)      Pour supernatant through "Miracloth" (Miracloth can be obtained from Calbiochem Corporation, Lajolla, CA92037, U.S.A.) filter into fresh tube containing 10 ml isopropanol.

g)     Mix and incubate at -20ºC for 30 min.

h)    Spin tube(s) at 20,000xg for 15 min (13,000 rpm in SS34 rotor).  

i)       Pour off supernatant and allow tube(s) to drain by inverting tube(s) on a paper towel.

j)       Redissolve pellet in 0.7 ml of 50mM Tris, 10mM EDTA, pH 8 and transfer to Eppendorf tube(s).  Spin in microfuge for 10 min to pellet insoluble debris.

k)    [Optional...] Transfer supernatant to fresh Eppendorf tube(s), add an equal volume of 1:1 Phenol/Chloroform, mix and spin in microfuge for 10 min.

l)       Transfer aqueous phase to fresh Eppendorf tube(s), add 1/10 volume 3M sodium acetate (75 ul) and 500 ul isopropanol.

m)  Mix well and pellet DNA by brief centrifugation in microfuge.  Wash pellet with 1 ml of ice-cold 80% ethanol.  Dry pellet and redissolve in 100 ul 10mM Tris, 1mM EDTA, pH 8.